一、实验目的

免疫组织化学技术是组织学中的常规实验技术，能够敏感的检测出标本中的抗原，对标本中的目的抗原进行定性、定位检测。通过学习免疫组织化学染色技术，熟练的运用到实验中去。

二、实验原理

1、免疫组织化学技术（immunohistochemicaltechnique）是利用抗原抗体反应进行的检测方法，及应用标记号的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。

2、内源性过氧化物酶的灭活：在免疫组化染色中，若采用过氧化物酶检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理，如果不处理，组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶，可与显色剂DAB、AEC其反应而造成假阳性，可能干扰染色结果。

3、血清封闭：一般在加一抗之前使用封闭血清，血清种属的选择一般与二抗的种属相同，可以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清，也可以免去此步骤。

4、抗原修复：是否进行抗原修复和所用方法并无太大关系，主要取决于切片类型，石蜡切片中，组织经甲醛固定后，蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联，抗原修复的目的就是打开醛键，羧甲键，或者是解开蛋白交联，因为这些原因可能导致抗原决定簇封闭。如果不进行抗原修复，抗原部位难以暴露，而其他固定剂固定的组织也就不存在这样的问题，自然没必要进行抗原修复。

三、实验材料和试剂：

1、仪器设备

微波炉、恒温箱、冰箱、微量加样器、湿盒、切片架、微波修复盒、染缸

2、试剂：

 ①PBS缓冲液（pH=7.2-7.6）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L.

②0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH=6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

③1mol/L的TBS缓冲液（pH=8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1mol/L的HCl调至pH=8.0，加水至1000ml.

④3%H2O2溶液：用30%H2O2溶液稀释配置。

⑤封片剂：中性树胶。

四、实验步骤

主要介绍SABC法

1、脱蜡和水化：

脱蜡前60℃恒温箱中烘烤60min

①  二甲苯Ⅰ：10min；

②  二甲苯Ⅱ：10min；

③  无水乙醇：5min；

④  95%乙醇：5min；

⑤  80%乙醇：5min；

⑥  70%乙醇：5min；

2、 SABC免疫组织化学染色：

①  PBS洗两次各5min；

②  用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10min，蒸馏水洗3次；

③  抗原修复：微波90-95℃30min，自然冷却；PBS洗5min；

④  滴加正常山羊血清封闭液，室温20min。甩去多余液体；

⑤  滴加一抗，室温1h或者4℃过夜或37℃1h；PBS洗三次，每次2min；

⑥  滴加生物素化二抗，20-37℃，20min；PBS洗三次，每次2min；

⑦  滴加试剂SABC，20-37℃，20min；PBS洗四次，每次5min；

⑧  DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）；

⑨  蒸馏水洗。苏木精复染2min，盐酸乙醇分化，自来水返蓝；

⑩  脱水、透明、封片、镜检。

五、实验结果分析：

1、抗原阳性结果 

2、抗原的定位 

3、阳性细胞组织学分布 

4、阳性标记强度特征