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免疫组织化学技术
2015-09-22 13:34   审核人:

 

一、实验目的

免疫组织化学技术是组织学中的常规实验技术,能够敏感的检测出标本中的抗原,对标本中的目的抗原进行定性、定位检测。通过学习免疫组织化学染色技术,熟练的运用到实验中去。

二、实验原理

1、免疫组织化学技术(immunohistochemicaltechnique)是利用抗原抗体反应进行的检测方法,及应用标记号的特异性抗原或抗体作为试剂,以检测标本中的抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物(如放射性核素、荧光素、酶等)进行标记,在与标本中的相应抗体或抗原反应后,可以不必测定抗原抗体复合物本身,而测定复合物中的标记物,通过标记物的放大作用,进一步提高了免疫技术的敏感性。

2、内源性过氧化物酶的灭活:在免疫组化染色中,若采用过氧化物酶检测系统,必须进行内源性过氧化物酶封闭处理,如果不处理,组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶,可与显色剂DABAEC其反应而造成假阳性,可能干扰染色结果。

3、血清封闭:一般在加一抗之前使用封闭血清,血清种属的选择一般与二抗的种属相同,可以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清,也可以免去此步骤。

4、抗原修复:是否进行抗原修复和所用方法并无太大关系,主要取决于切片类型,石蜡切片中,组织经甲醛固定后,蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联,抗原修复的目的就是打开醛键,羧甲键,或者是解开蛋白交联,因为这些原因可能导致抗原决定簇封闭。如果不进行抗原修复,抗原部位难以暴露,而其他固定剂固定的组织也就不存在这样的问题,自然没必要进行抗原修复。

三、实验材料和试剂:

1、仪器设备

微波炉、恒温箱、冰箱、微量加样器、湿盒、切片架、微波修复盒、染缸

2、试剂:

 PBS缓冲液(pH=7.2-7.6):NaCl 137mmol/LKCl 2.7mmol/LNa2HPO4 4.3mmol/LKH2PO4 1.4mmol/L.

0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CBpH=6.01000ml):柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g

1mol/LTBS缓冲液(pH=8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1mol/LHCl调至pH=8.0,加水至1000ml.

3%H2O2溶液:用30%H2O2溶液稀释配置。

⑤封片剂:中性树胶。

四、实验步骤

主要介绍SABC

1脱蜡和水化:

脱蜡前60℃恒温箱中烘烤60min

 二甲苯Ⅰ:10min

 二甲苯Ⅱ:10min

 无水乙醇:5min

 95%乙醇:5min

 80%乙醇:5min

 70%乙醇:5min

2 SABC免疫组织化学染色:

 PBS洗两次各5min

 用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5-10min,蒸馏水洗3次;

 抗原修复:微波90-9530min,自然冷却;PBS5min

 滴加正常山羊血清封闭液,室温20min。甩去多余液体;

 滴加一抗,室温1h或者4℃过夜或371hPBS洗三次,每次2min

 滴加生物素化二抗,20-37℃,20minPBS洗三次,每次2min

 滴加试剂SABC20-37℃,20minPBS洗四次,每次5min

 DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度);

 蒸馏水洗。苏木精复染2min,盐酸乙醇分化,自来水返蓝;

 脱水、透明、封片、镜检。

五、实验结果分析:

1、抗原阳性结果 

2、抗原的定位 

3、阳性细胞组织学分布 

4、阳性标记强度特征 

 

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