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石蜡组织切片的H E染色
2015-09-22 13:31   审核人:

 

一、实验目的

苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法,简称HE染色方法,是常规病理制片最基本的染色,能够对正常组织和病理组织进行形态结构的观察。通过本实验的学习,了解HE染色的方法,学会观察正常组织和病理组织。

二、实验原理

1、细胞核染色的原理:苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。

2、细胞浆染色的原理:伊红是一种化学合成的酸性染料,在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质,为两性化合物,细胞浆的染色与染液的pH在胞浆蛋白质等电点(4.75.0)以下时,胞浆蛋白质以碱式电离,则细胞浆带正电荷,就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子,与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合,使细胞浆着色,呈现红色。

3、分化作用:染色后,用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去,这个过程称为分化作用,所用的溶液称为分化液。在HE染色中用1%盐酸乙醇作为分化液,因酸能破坏苏木精的醌型结构,使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后,必须用1%盐酸乙醇分化,使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去,在进行伊红染色,才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此,在HE染色中分化是极为关键的一步。

4、返蓝作用:分化之后,苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,呈红色,在碱性条件下处于蓝色离子状态,呈蓝色。组织切片经1%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色,故分化之后,立即用水出去组织切片上的酸而终止分化,再用弱碱性水(0.2%氨水)使苏木精染上的细胞核呈现蓝色,这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。

三、实验材料和试剂:

1、苏木精染液:

苏木精染液配制方法有多种,Harris苏木精染液是最常用的一种,其配方如下:

苏木精:1g

无水乙醇:10ml

硫酸铝钾:20g

蒸馏水:200ml

氧化汞:0.5g

冰醋酸:8ml

配制步骤:先用无水乙醇溶解苏木精,用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾,再将这两种液体混合后煮沸(约1min),离火后向该混合液中迅速加入氧化汞,并用玻璃棒搅拌至染液变为紫红色(此时有大量气泡产生,故容器宜大,以防液体溢出),随即用冷水冷却至室温,然后加入冰醋酸并混匀,过滤后使用。

2、伊红染液

伊红染液有是水溶性和醇溶性两种,常用的为0.5%水溶性伊红染液,其配方如下:

伊红Y0.5g

蒸馏水:100ml

配制步骤:先用少许蒸馏水溶解伊红Y,然后加入全部蒸馏水,用玻璃棒搅拌均匀,过滤后使用(也可不过滤)。

3、1%盐酸乙醇分化液

36%38%盐酸:1ml

75%乙醇:99ml

4、0.2%氨水(pH7.58之间)

25%28%氨水:0.2ml

自来水:100ml

四、染色步骤与方法:

1、烤片:1小时,温度60(目的:使组织切片与载玻片贴合的更加紧密)

2、切片脱蜡至水:

      ①二甲苯Ⅰ:10min

       ②二甲苯Ⅱ:510min(时间长短视脱蜡情况而定)

       ③无水乙醇Ⅰ:35min

       ④无水乙醇Ⅱ:35min

       95%乙醇:35min

       95%乙醇:35min

       85%乙醇:35min

       75%乙醇:35min

⑨自来水洗:2min

3、染色:

       ①苏木精染色:510min

       ②自来水洗:1min

       1%盐酸乙醇分化:数秒

       ④自来水洗:1min

       0.2%氨水返蓝:30s±

       ⑥自来水洗:1min

       ⑦伊红染色:35min

       ⑧自来水洗:速洗

4、脱水、透明、封固

       80%乙醇:1020s

       90%乙醇:1020s

       95%乙醇Ⅰ:23min

       95%乙醇Ⅱ:23min

       ⑤无水乙醇Ⅰ:35min

       ⑥无水乙醇Ⅱ:35min

       ⑦二甲苯Ⅰ:35min

       ⑧二甲苯Ⅱ:35min

       ⑨二甲苯Ⅲ:35min

       ⑩中性树胶封固

五、染色结果

细胞核呈蓝色,细胞浆呈粉红色至桃红色,胶原纤维呈淡粉红色,红细胞呈较鲜艳的橘红色。钙盐、细菌菌落呈蓝色或紫蓝色。

 

六、注意事项

1、染色前,切片脱蜡应彻底。若脱蜡不彻底,则影响着色。

2、染色时间与染液的新旧程度有关,不能一成不变。新配制的染液着色力较强,染色时间可适当缩短;反之,则适当延长。伊红染色程度应以苏木精对核的着色程度为参照标准,掌握其染色时间,已达到对比鲜明为宜。

3、伊红染液的pH值不能低于细胞核染色体等电点(pI=3.3),否则染色体也可表现碱式电离带正电荷,而被伊红染液染色,使细胞浆与细胞核区分不开。因此伊红染液的pH值应小于胞浆蛋白等电点,而大于胞核染色体等电点,在3.6-4.7之间。

4、掌握好分化程度,分化时要认真观察,精心操作,观察切片由深蓝色变成红色或粉红色时,立即将切片置入自来水中终止分化。

5、封固用的中性树胶的浓度要适宜,避免产生气泡。如中性树胶过稀,容易溢出盖玻片的周围,且树胶内的二甲苯易挥发,树胶干燥浓缩后可产生气泡。如中性树胶过浓稠,滴后不容易扩散,有气泡不易排出。若封固后气泡存留,既影响切片观察,又影响切片保存。因此有气泡产生时,应轻轻按压盖玻片,将气泡驱除。

 

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